作为分子生物学和蛋白质组学研究中应用最广泛的技术之一，蛋白质印迹法（WesternBlotting，WB）诞生四十年来，一直稳坐蛋白质研究技术的“头把交椅”。关于WB，几乎每一位经验丰富的实验老手都有着一本厚厚的血泪史，一个个二十出头的青年被这位「中年大叔」整天按在地上摩擦…
WB究竟有多“玄”呢？
一个完整的WB包括了很多个步骤，从蛋白提取到配胶、上样电泳，再到转膜、封闭，最后孵育一抗二抗后才能去进行检测。时间跨度非常长，而且这中间的每一步都包含了很多的小细节，稍有不慎就会导致结果出错，然后又得从头来过。蛋白质条带大小和预测值不符那是常有的事儿，甚至江湖传言称，#一个生物学博士，要跑满面胶才有可能毕业#
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但是近年来WesternBlotting总是与“造假”、“撤稿”、“学术不端”等词一同出现，通过WesternBlot进行半定量分析的准确性和重复性逐渐受到来自学界的质疑，在著名的学术打假平台RetractionWatch网站上，光是用「Westernblot」这个关键词就能搜出多篇文章和报道。这也使得主流期刊对文章中WB数据的要求越来越高，包括确保可重复性和定量准确性等。
图片来源：RetractionWatch
如何跳出WB设下的陷阱？想获得可靠、线性的定量WesternBlot数据，高质量的样品制备和优化的实验方案必不可少。一起来看看学术打假先锋ElisabethBik对WB的独家见解和操作攻略：
凝胶电泳步骤
配制凝胶时，先配分离胶，再配浓缩胶。可根据目标蛋白分子量大小选择合适的分离胶浓度，一般分子量越高，分离胶浓度越低；浓缩胶浓度多为5%。
值得注意的是，玻璃板清洗干净后，可用烘箱将水分晾干，待温度降至室温后，再灌胶，避免产生气泡；加水液封时，速度要慢，用1ml抢沿着胶板上沿反复移动，避免分离胶高低不平，影响蛋白分离。
蛋白质印迹步骤
在这个过程中，需将分离的蛋白质转移到膜上，然后与特异性抗体一起孵育，转膜需要在冰浴中进行，凝胶和转印膜间不要留有气泡，否则气泡处的条带可能就不能转移到膜上了，同时要注意电极方向。转膜后的效果可通过丽春红染色或预染Marker来判断。
内参的选择
选择好合适并且好跑的内参，WB实验也就成功了一半。一般情况下，做全细胞和细胞质的WB实验时，选择β-actin基本能满足大部分的需要。而考察细胞核样品时，由于HistoneH3是染色体的组成型表达组分，表达相当稳定，并且特别好跑，可以算是细胞核内参的首选。
另外，针对一些特定的内参，蛋白上样量超过一定的量时，出来的条带可能不会有显著的差别。以前看过一篇文献讲的应该是β-actin，当上样量超过20μg时，条带灰度不会呈线性的增加。因此，在做WB校正时，调节合适的上样量也是影响实验成功较大的一个因素。
结果的独一无二
正常步骤做出来的WB条带，形状可以像煎饼，哑铃，鱼，等，这主要取决于研究人员如何将样品加载到凝胶上，蛋白质的量以及凝胶设备的特性。然后，凝胶带和背景上还有斑点、污渍、划痕、气泡和其他不规则现象。
所有这些变化让每个WB的条带都应该是独一无二的，如果有两条非常相似的条带，那就要怀疑下结果的真实性了，当然，除此之外还有噩梦一般的——白板...
每个做WB的科研人的终极噩梦——白板
图片来源：丁香园论坛上的网友
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